Antecedentes
La monitorización de la Enfermedad Residual Medible (MRD) , para los propósitos de este blog, será el acto de buscar variantes somáticas en una muestra de biopsia líquida mediante el análisis de ADN libre de células circulantes (ccfDNA). Esto se hace para monitorear la desaparición de un tumor sólido metastásico durante el tratamiento y para seguir cualquier resurgimiento futuro de ese cáncer. El análisis de ccfDNA supone que estará presente ADN tumoral circulante (ctDNA), y la frecuencia media de ctDNA en muestras de pacientes a través de cánceres parece estar alrededor del 0,5 al 1%. Por lo tanto, la mediana de las frecuencias alélicas variantes (VAF) de las variantes somáticas comenzará alrededor de este rango, y el objetivo de la monitorización de la ERM es poder detectarlas en VAF mucho más bajas. Esto puede ser un desafío y si vamos a diseñar un ensayo para el monitoreo de MRD, entonces debemos conocerlos y superarlos.
Desafíos
Las partes desafiantes del monitoreo de MRD son:
- Necesidad de seguir variantes que pueden comenzar cerca del límite de detección (LOD) de un ensayo de ctDNA típico
- Detección de las variantes en VAF que pueden caer mucho más de un orden de magnitud por debajo de las VAF iniciales
Por ejemplo, si los VAF estaban alrededor del 0,5% al principio, entonces una reducción del 90% en el contenido del tumor podría moverlos al 0,05%, lo que podría indicar que el tratamiento elegido está funcionando, pero el 10% del tumor todavía estaría presente. En algún momento, es posible que desee detectarlos al 0,005% e, idealmente, no en absoluto (¡pero no porque el ensayo no funcione!). Dado que el LOD, definido como la capacidad de detectar algo el 95% del tiempo, para una variante en un ensayo típico de ctDNA puede estar en y por encima del 0.1% VAF 1,2 , intentando detectar variantes en VAF que están muy por debajo de dicho LOD puede requerir un tipo diferente de ensayo de ctDNA.
A medida que los VAF disminuyen, es posible que algunas variantes somáticas ni siquiera estén presentes en una muestra de biopsia líquida determinada. Si bien se ha observado que algunos pacientes con cáncer tienen concentraciones más altas de ccfDNA, durante la monitorización de la ERM, se supone que los niveles de ccfDNA volverán a los niveles normales tras la eliminación del tumor. Por tanto, supongamos un rendimiento de aproximadamente 30 ng de la muestra de un solo paciente. Un ensayo de MRD debería funcionar con esta cantidad de entrada de cfDNA. En teoría, se podría recolectar más sangre, pero eso presenta desafíos adicionales y es posible que no queramos analizar más ccfDNA. Los 30 ng representan aproximadamente 8.000 equivalentes genómicos y se esperaría que una variante dada con una VAF al 0,1% tenga aproximadamente 8 copias. A 0.01% VAF, se esperaría que estuviera presente menos de una vez. Dado que no se esperaría que una variante al 0.01% VAF esté presente en una muestra de 30 ng el 95% del tiempo, el LOD para una única variante debe ser superior al 0,01%. Por lo tanto, un ensayo de MRD necesita monitorear muchas variantes en la misma muestra para obtener un LOD para el tumor a niveles donde la mayoría de las variantes estarían alrededor del 0,01% de VAF. Debido a la necesidad de monitorear muchas variantes en la misma muestra, la secuenciación de próxima generación (NGS) es un método preferido. Al desarrollar un ensayo clínico, es importante tener en cuenta que a la FDA le gustaría que los ensayos de MRD, al menos para las neoplasias malignas hematológicas, tengan LOD 10 veces por debajo del punto de decisión clínica. La secuenciación de próxima generación (NGS) es un método preferido. Al desarrollar un ensayo clínico, es importante tener en cuenta que a la FDA le gustaría que los ensayos de MRD, al menos para las neoplasias malignas hematológicas, tengan LOD 10 veces por debajo del punto de decisión clínica. La secuenciación de próxima generación (NGS) es un método preferido. Al desarrollar un ensayo clínico, es importante tener en cuenta que a la FDA le gustaría que los ensayos de MRD, al menos para las neoplasias malignas hematológicas, tengan LOD 10 veces por debajo del punto de decisión clínica.3 . Por lo tanto, si se cambia el tratamiento (o se inicia el tratamiento, etc.) con un contenido tumoral de ~ 0.01%, entonces el LOD de un ensayo de monitoreo clínico de ERM debe ser de contenido tumoral ~ 0.001%. Eso es muy bajo.
Si vamos a monitorear variantes en VAFs muy bajos donde algunas variantes no estarán presentes en la muestra, entonces es posible que también necesitemos eliminar algunas de las seguridades que están integradas en los ensayos típicos de ctDNA NGS. Por ejemplo, algunos ensayos de ctDNA no informarán variantes por debajo del 0,1%, pero eso se vuelve necesario para el monitoreo de MRD. Además, con un contenido de tumor del 0,01%, algunas variantes no estarán presentes en una muestra y muchas variantes solo estarán presentes en 1 o 2 copias. Para tener en cuenta la posibilidad de errores en el ensayo relacionados con observaciones inesperadas de variantes, los ensayos de ctDNA pueden requerir un número mínimo de observaciones de una variante, que puede ser 3 o 4. En este punto, debemos familiarizarnos con las distribuciones de Poisson 4. Es muy poco probable observar una variante al menos 4 o 5 veces cuando se espera que esté presente menos de una vez. Por lo tanto, es posible que debamos reducir el número mínimo de observaciones a 1 o 2. En esos niveles, es importante estar muy seguro de que las variantes observadas estaban realmente presentes en la muestra y no fueron introducidas por el flujo de trabajo del ensayo, especialmente, dado la tasa de error de la secuenciación NGS.
Finalmente, los ensayos de ctDNA pueden ser costosos de ejecutar, especialmente aquellos con paneles grandes. El seguimiento implica repetir la prueba; y, si los análisis son costosos, entonces puede haber menos pruebas repetidas o ninguna prueba. Entonces, necesitamos administrar el costo por ensayo.
Estén atentos la próxima semana para la segunda parte de este blog, donde discutiremos cómo se pueden superar los desafíos encontrados en la detección de MRD.
