En un seminario web sobre biopsia líquida de 2020 , el profesor Schuuring analizó la gran cantidad de opciones disponibles para detectar mutaciones de bajo número de copias en el ADNcf en plasma de pacientes con cáncer de pulmón. Su laboratorio de investigación combina enfoques de NGS, ddPCR, qPCR y espectrometría de masas para abordar tres aplicaciones principales: (1) diagnóstico primario mediante la detección de mutaciones predictivas, (2) monitoreo de la respuesta al tratamiento basado en cambios en los niveles de mutantes en plasma y (3) detección de los mecanismos de resistencia a la terapia.
En todas las etapas del ciclo de tratamiento, estratificación y manejo del paciente, los médicos se enfrentan a un equilibrio entre el costo, la sensibilidad, la amplitud de la cobertura de la mutación y el tiempo de respuesta de los diferentes métodos de prueba disponibles. Según el profesor Schuuring, no existe un enfoque único que se ajuste a todas las necesidades clínicas, mientras que la aprobación de las pruebas por parte de la FDA también se está quedando atrás de los esfuerzos de investigación. Por ejemplo, al monitorear la respuesta al tratamiento, su laboratorio a menudo se basa en ddPCR, que detecta mutaciones únicas de manera rápida y económica con una sensibilidad excelente. Con esta tecnología, han seguido recientemente a más de 100 pacientes durante el tratamiento de inmunoterapia con una supervivencia que se correlaciona con los niveles de una única mutación KRAS G12V, detectable con una sensibilidad VAF del 0,1% en un entorno clínico.
Sin embargo, una sola mutación no siempre predice la respuesta al tratamiento y ahí es donde entran en juego los enfoques basados en NGS, como el ensayo de ADNct de Roche Avenio. Permiten monitorear una gran cantidad de mutaciones en múltiples genes a la vez, pero tienen un precio, tiempo de respuesta y costo mucho más altos.
Al detectar mutaciones asociadas con mecanismos de resistencia a la terapia, el laboratorio del Dr. Schuuring utiliza un enfoque multiplataforma que incluye qPCR COBAS ctEGFR v2, ADNct de pulmón Ageno UltraSEEK basado en espectrometría de masas, así como el ensayo de ADNct de Roche Avenio basado en NGS. El laboratorio ha demostrado recientemente una buena concordancia entre la plataforma Agena (MS) y otros métodos (qPCR y NGS), pero depende en gran medida de la cantidad de material de entrada, con una concordancia del 100% en las mutaciones de EGFR alcanzadas cuando se utilizan al menos 10 ng de entrada. cfDNA 1.
En el evento del seminario web, el profesor Schuuring mencionó que en un entorno clínico típico, las pruebas de biopsia líquida y de tejido sólido a menudo no se realizan en paralelo, por lo que a menudo no hay datos sobre la concordancia directa de los resultados para cada paciente. Sin embargo, el estudio de validación mostró un alto nivel de concordancia con las mutaciones detectadas en el ctDNA encontradas en las muestras de tejido. Guardant Health también publicó datos que muestran una concordancia similar. Sin embargo, debido a que alrededor de un tercio de los tumores sólidos no arrojan ctDNA, depender solo de las pruebas de ctDNA significa que existe la posibilidad de pasar por alto estos casos mediante la prueba de biopsia líquida.
Preguntas y respuestas con el profesor Schurring:
¿Cuál sería su consejo para aquellos que buscan pasar de la prueba de tejido a la prueba de ctDNA por primera vez?
Prof Schuuuring: ¡ Estandarización y armonización! Al elegir una tecnología, siempre existe la decisión entre las opciones baratas y rápidas o las opciones completas que también serían apropiadas para la preselección. Recomendó seguir las pautas Cancer-ID y IQN-Path para garantizar la estandarización de los procedimientos preanalíticos en los laboratorios clínicos CAP / CLIA.
¿Podría ampliar más la idea de utilizar un método con menor sensibilidad como herramienta de detección?
Profesor Schuuuring:Para que el cribado identifique y / o clasifique el cáncer en pacientes de alto riesgo, o para la detección temprana del cáncer para predecir un alto riesgo de desarrollar metástasis o recurrencia, se necesitan métodos de ctDNA distintos a los que presenté, a menudo denominados ultra -ensayos de ctDNA sensibles. Originalmente, se usaba la secuenciación muy profunda, a menudo restringida a 1 o pocos marcadores, pero para poder identificar estos niveles bajos de células cancerosas en todos los pacientes de alto riesgo, los ensayos más nuevos se basan en enfoques ultrasensibles que utilizan paneles más grandes. WGS o perfiles de metilación. Los datos más recientes muestran especialmente el poder de combinar tales ensayos. Algunos ejemplos serían PanSEEK, CancerSEEK, GRAIL, Guardant360 / OMNI, FoundationOne Liquid y TRACERx 2 .
Para ddPCR con una sensibilidad del 0,1% y una entrada de masa de 10 ng de cfDNA, ¿implica que no hay gotitas de falsos positivos en los controles negativos?
Prof. Schuuuring: Para cada ensayo de ddPCR por separado, determinamos el número de gotas de FP en numerosas muestras de NTC en nuestro laboratorio (en una sala súper limpia para configurar las pruebas de ddPCR para tomar precauciones importantes para evitar la contaminación cruzada) y todas las ejecuciones suelen mostrar en su mayoría, no hay gotas mutantes (<2) consideradas como gotas FP. Cualquier análisis que muestre más de 2 gotas en las muestras de control NTC se considera no válido. En otras palabras, una muestra con> 3 gotas se considera verdaderamente positiva. Además, necesitamos un mínimo de 333 gotas / muestra en total (sensibilidad 3/333 = 1%) para poder definir una muestra como ddPCR-negativa 3. Utilizando material de referencia, se pueden lograr altas sensibilidades y asociarlas con la entrada de ADN. En muestras clínicas, generalmente alcanzamos sensibilidades de 0.01-0.1% con una entrada de 20 ng y 0.1-1% a 2 ng. En mi presentación, también demostré que el% CV relacionado con el ADN de entrada debe tenerse en cuenta 4 .
¿Cuál es la VAF mediana en las muestras y cómo varía con las diferentes etapas del cáncer de pulmón?
Profesor Schuuuring:El análisis NGS reciente de 340 muestras de plasma en CPCNP en estadio avanzado mostró variantes con VAF que variaban del 0,01 al 60% (incluso variantes dentro del mismo plasma). La mayoría de las variantes tenían VAF <1%. El número de copias mutantes / ml de plasma se correlaciona con el estadio de la enfermedad (volumen total del tumor) como se observa en otras neoplasias malignas notificadas. En GIST mostramos que detectamos ctDNA solo en enfermedad metastatizada (no en enfermedad localizada) independientemente del tamaño del tumor. Finalmente, al monitorear la respuesta al tratamiento, el éxito del tratamiento también se asocia con los niveles de ctDNA. Tenga en cuenta que la cantidad total de cfDNA está influenciada por la recolección, el almacenamiento y el procesamiento, ya que debido a la hemólisis, la VAF puede cambiar debido a factores técnicos. La estandarización es fundamental.
¿Puede comentarnos sobre el análisis del ctDNA en el cáncer de próstata metastásico?
Profesor Schuuuring:Este campo está evolucionando rápidamente recientemente con la detección de marcadores SNV pronósticos / predictivos, específicamente para la variante AV y, más recientemente, la HRD. Para estos fines, se han informado varios métodos LDT NGS. Y al igual que con otras neoplasias malignas, es necesario realizar una biopsia líquida, ya que no en todas las situaciones se pueden obtener biopsias de tejido adecuadas.
Con CV para ddPCR en 20% -30% -40% alrededor de 0,1% AF, ¿cómo puede seguir aplicando la tecnología con precisión en torno a los pequeños aumentos utilizados para detectar la eficacia de la terapia?
Profesor Schuuuring:En este estudio ilustramos que se debe considerar ese tema. También mostramos que (cuando esté disponible) se debe usar suficiente cfDNA y cualquier valor por debajo de 10 ng no es muy confiable <1>. Los datos preliminares de NGS usando cfDNA durante el tratamiento revelaron que una disminución> 50% en los niveles de ctDNA variante cuando se compara el cfDNA recolectado en la primera evaluación de respuesta con la muestra previa al tratamiento, también los pacientes con VAF baja se asocian con resultados clínicos similares a los de VAF > 1%.
¿Alguna idea de si la prueba de HRD se puede realizar mediante biopsia líquida?
Profesor Schuuuring:Varios ensayos están validados para esto, como cfDNA como FoundationOne Liquid Cdx (aprobado por la FDA para BRCA1 / 2), GUARDANT360 que incluye BRCA1 / 2 y algunos otros. HRD fue desarrollado para pruebas de ctDNA y ambos métodos se ofrecen como servicio. Otras opciones de detección de ctDNA disponibles son TSO500 (que cubre todos los genes HRD) y Avenio-Expanded (BRCA1 / 2).
Según su experiencia, ¿recomienda un enfoque basado en UMI para detectar una carga de alelos mutantes baja por debajo del 0,5%?
Profesor Schuuuring: Sí, especialmente cuando se utilizan paneles más amplios y las UMI se están convirtiendo en una práctica común para todos los ensayos de ADNc NGS.
¿Existe un ensayo de concordancia entre tejido y ccfDNA NGS para amplificaciones y fusiones?
Profesor Schuuuring:No. En mi opinión, en la actualidad, el ctDNA NGS no detecta de manera confiable CNV (amplificación) verdadera en plasma con ctDNA <0.1% de carga tumoral. Los datos que utilizan la secuenciación del genoma completo de baja cobertura parecen ser más fiables para detectar NVC en plasma. Con respecto a la detección de fusión, los reordenamientos más comunes se incluyen en los enfoques de NGS basados en el genoma, pero debe tener en cuenta que esto no cubrirá todas las rupturas, ya que están dispersas en regiones muy grandes y, a menudo, con muchos socios (> 50). En las pruebas de predicción de tejidos, utilizamos enfoques de NGS basados en ARN (como Archer) que nos permiten detectar casi todas las fusiones de los marcadores de interés. El uso de ARN circulante (ya sea libre, en EV o en plaquetas) está bajo investigación y lejos de su implementación en la actualidad.
¿Es un problema la menor sensibilidad para detectar genes de fusión distintos de SNV o indeles? ¿Cuál crees que sería la solución?
Prof. Schuuuring: La respuesta está relacionada con la sensibilidad clínicamente relevante de su prueba. ¿Necesitamos una VAF <0.01% y cómo debemos tomar decisiones de tratamiento para una VAF tan baja (para pruebas predictivas de ctDNA)? La cobertura es un desafío para las pruebas predictivas óptimas, mientras que para la monitorización (como para SNV) podría ser útil una VAF más baja. Todavía queda trabajo por hacer aquí.
¿Vio un aumento en el número de solicitudes de biopsia líquida en los diagnósticos en los últimos años? ¿Cree que los oncólogos comprenden el poder de esta tecnología?
Profesor Schuuuring:Sí, especialmente con la aprobación de osimertinib para pacientes resistentes a los inhibidores de la tirosina quinasa con mutación T790M. Hay una necesidad de muchas aplicaciones y hay enormes esfuerzos en el ámbito de la investigación, pero la falta de utilidad clínica (utilizando estudios prospectivos) y los costos relativamente altos de las pruebas de ctDNA y la falta de un reembolso adecuado por parte de las compañías de seguros retrasan la implementación en la práctica clínica.
